Tartalom
- Az elektroforézis korlátozott mintanalízist tartalmaz
- Az elektroforézis mérése nem pontos
- Alapvető indulási minta szükséges
- Csak bizonyos molekulákat lehet megjeleníteni
- Az elektroforézis alacsony teljesítmény
A gélelektroforézis olyan módszer, amelyben a biológiai molekulákat elválasztják egymástól és azonosítják biológiai kutatás vagy orvosi diagnosztika során. Az 1970-es évek fejlesztése óta ezek a technikák felbecsülhetetlen értékűek a kutatás szempontjából érdekes gének (DNS) és géntermékek (RNS és fehérje) azonosításában. Az utóbbi években újabb technikák alakultak ki, amelyek pontosabbá és részletesebbé teszik az élő rendszerekben zajló eseményeket. Noha ezek nem helyettesítették az elektroforézis technikákat, és a fejlett manipulációk megnövelhetik a technika életképességét, fontos felismerni, hogy a gélelektroforézis mit képes és mit nem tud megtenni.
Az elektroforézis korlátozott mintanalízist tartalmaz
Az elektroforézis minden szövetre jellemző, amelyből mintát vett. Például, ha Southern blotot (egyfajta elektroforézist) hajt végre egy arctapinton, akkor az arc epiteliális sejtjeiből és a testében sehol más helyre mutató génekre néz. Időnként ez hasznos lehet, de a kutatókat gyakran érdekli a szélesebb körű hatások.
Az olyan technikák, mint például az in situ hibridizáció (ISH), a szövetek egy részét felvehetik és a gén expresszióját elemezhetik a minta mindegyik kis területén.Így a kutatók az ISH-val egy minta minden agyterületét megnézhetik, míg az elektroforézis technikák egyszerre csak néhány területet nézhetnek meg.
Az elektroforézis mérése nem pontos
A gélelektroforézis hatékonyan elválaszthatja a különféle súlyú hasonló fehérjéket (ezt Western blot-nak nevezzük). Pontosabban elválaszthatja őket egy 2d elektroforézis néven ismert módszerrel; ez gyakori a proteomikában.
Sajnos az ezzel a technikával végzett összes mérés a legjobb esetben félkvantitatív. A fehérjék pontos tömegének (tömegének) eléréséhez tömeg-spektroszkópiát kell alkalmazni, miután a fehérjét elektroforézissel megtisztították. Ezenkívül a különféle molekulák relatív mennyiségének összehasonlítása a gélben lévő különböző foltok sűrűségén (sötétségén) alapul. Ennek a módszernek van bizonyos fokú hibája, és a mintákat általában többször futtatják, hogy tiszta eredményeket kapjanak.
Alapvető indulási minta szükséges
Az elektroforézis a különböző biomolekulák izolálásának és vizuális azonosításának technikája. Ezt úgy hajtják végre, hogy egy elektromos áramot vezetnek át a gélen, hogy különféle tömegű töltött molekulákat különítsenek el. Ha az ön iránt érdeklődő molekula nem elég gyakori, akkor a sáv gyakorlatilag láthatatlan és nehéz mérni.
A DNS-t és az RNS-t kissé meg lehet amplifikálni az elektroforézis megkezdése előtt, de gyakorlatilag nem célszerű ezt fehérjékkel megtenni. Ezért e vizsgálatok elvégzéséhez nagy szövetmintára van szükség. Ez korlátozhatja a technika hasznosságát, különösen az orvosi elemzésben. Gyakorlatilag lehetetlen elektroforézist végezni egyetlen cellából vett mintákon; az áramlási citometriát és az immunhisztokémiát gyakrabban használják a fehérjék sejt-sejt-expressziójának felmérésére. A PCR-nek nevezett technika kiválóan alkalmas apró RNS-mennyiség pontos mérésére.
Csak bizonyos molekulákat lehet megjeleníteni
Az elektroforézis kiválóan alkalmas a közepes és nagy méretű biomolekulák elválasztására és azonosítására. Ugyanakkor sok olyan molekula, amelyet a kutatók meg akarnak nézni, kisebb; a kis hormonok, idegátadók és ionok nem mérhetők elektroforézissel. Ennek két oka van: nem reagálnak megfelelően az elektroforézis készítménnyel (általában SDS PAGE elnevezésű technikával), és még ha igen, akkor is túl kicsi ahhoz, hogy megfelelően elváljanak, és kiürítik a gél alját. Ezeket a molekulákat ehelyett olyan technikákkal mérik, mint például RIAA-k (radioimmunitestek) és ELISA-k (enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálat).
Az elektroforézis alacsony teljesítmény
A gélelektroforézis általában alacsony áteresztőképességgel rendelkezik, ami azt jelenti, hogy nem szolgáltat különösen gyorsan adatokat. Kontraszt elektroforézis, ahol egyszerre néhány maroknyi RNS-molekulát tekinthet meg PCR-rel (polimeráz láncreakció), amely egyidejűleg több ezer mintát képes kiértékelni. Hasonlóképpen, az áramlási citometria az egyes sejtek ezreitől képes méréseket végezni, és összetett összefüggéseket hozhat, míg az elektroforézis a sejteket tömegesen vizsgálja, és nem képes ilyen finom megkülönböztetésre. A PCR és az áramlási citometria tömegesen párhuzamos és soros folyamatokat képvisel, és mindkettő messze meghaladja az elektroforézis képességét kutatási adatok előállítására.