Tartalom
Nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) végzett munka során a megbízható, minőségi eredmények biztosításához elengedhetetlen a jó kalibrálás. A HPLC-eszköz megfelelő kalibrálása a megfelelő kalibrációs standard elkészítésével kezdődik. A legtöbb esetben a kalibráláshoz valóban egy sor növekvő koncentrációra vonatkozó standard szükséges, hogy elkészítsük az úgynevezett kalibrációs görbét. Ez egy ábrázolt vonal és a hozzá tartozó egyenlet, amely leírja a vizsgált vegyi anyag koncentrációja és a HPLC detektor reakciója közötti összefüggést.
Határozzuk meg azt a vegyi anyagot, amelyet meg akarunk vizsgálni a HPLC alkalmazásával ("analit"). Előfordulhat például, hogy kipróbál egy üdítőital-sorozatot fruktóztartalom szempontjából, amely esetben a fruktóz lenne az analit.
Szerezze be a tisztaságú analit vegyi anyag mennyiségét. Általában a tisztaságnak meghaladja a 99% -ot, és az analitot jó hírű vegyianyag-szállítótól kell vásárolni. Például a fruktóz esetében a tiszta fruktózt vegyszer-eladótól vásárolják, nem pedig élelmiszerbolttól.
Határozza meg a vizsgálandó anyag maximális és minimális várható koncentrációját a mintákban, amelyeket HPLC-vel tesztelni kíván. Alkoholmentes italok esetében meg kell vizsgálnia az italok címkéit, és meg kell határoznia a legalacsonyabb és legmagasabb fruktóztartalmat a vizsgált italok között. Ne feledje, hogy a kiindulási mintát (üdítőital) hígíthatják vagy más módon manipulálhatják az elemzésre való felkészülés során (az alkalmazott HPLC-módszertől függően), és így a HPLC-re ténylegesen beinjektált mintákban az analit koncentrációja módosítható. A mintákban a HPLC-vel végzett analit-koncentrációt kell figyelembe venni.
Határozza meg az oldószert, amelyben fel fogja oldani a vizsgálandó anyagot, hogy kiállítsa a kalibrációs szabványokat. Ennek az oldószernek képesnek kell lennie az analit megfelelő feloldására viszonylag széles koncentrációtartományban (legalább olyan magas, mint a vizsgálni kívánt mintákban). Szintén ennek az oldószernek ideális esetben meglehetősen hasonlónak kell lennie a "mozgófázishoz": annak a mintának a HPLC-készüléken keresztüli átviteléhez használt oldószerrel.
Számítsa ki az analit mennyiségét, amely ahhoz szükséges, hogy az analit "alapanyag" oldatához jusson. Ezt úgy kapjuk meg, hogy megszorozzuk a törzsstandard kívánt koncentrációját a kívánt térfogattal. Az analizált anyag koncentrációjának ebben az oldatban legalább 10% -kal magasabbnak kell lennie, mint a legmagasabb várt mintakoncentrációnak. Ha az üdítőital-mintában a legmagasabb várt fruktózkoncentráció 8 gramm / 100 ml, akkor az alapanyagot 10 gramm fruktóz / 100 milliliter koncentrációra lehet állítani. Az ésszerű térfogat 500 milliliter, így 8/100 ml x 500 ml = 40 gramm fruktózra lenne szükség.
Mérjük meg a szükséges mennyiségű elemzést megfelelő pontosságú szintre. Gyakran megfelelő egy grammban kifejezett, egy vagy két tizedes pontossággal megadott érték, de néhány módszernél nagyobb pontossággal lehet szükség lehet.
Tegyük a lemért analitot a szükséges térfogatú mérőlombikba, és adjuk hozzá a kívánt oldószert a lombik töltési jeléhez. Mérőlombik (például nem főzőpohár főzőpohár használata) növeli a törzs standard koncentrációjának pontosságát. Győződjön meg arról, hogy az összes analit átkerült a lombikba; Használjon valamilyen oldószert, ha szükséges, mossa le.
Zárjuk le a mérőlombikot, és óvatosan rázzuk fel vagy fordítsuk meg, amíg a vizsgálandó anyag teljesen fel nem oldódik.
Készítsen sorozatot a törzsstandard változó hígításaiból úgy, hogy az ismert törzsstandard mennyiségeket átviszi a mérőlombikba, pipetták segítségével a pontos átvitelhez, majd az oldószer hozzáadásával. A legalacsonyabb standard koncentrációnak a legalacsonyabb várt elemzendő minta alatt kell lennie. Az üdítőital példában, ha a mintában a legalacsonyabb várt fruktózkoncentráció 2 g / 100 ml, akkor 1 gramm / 100 ml-es szabványt lehet készíteni. Ezt a tőzsdei standard tízszeres hígításával valósítják meg. A standard sorozatnak összesen 5 vagy 6 koncentrációt kell tartalmaznia, tehát további hígításokra szükség lehet 3, 5 és 8 gramm fruktóz / ml standard előállításához. Most van egy sor szabványos megoldás, amelyekkel a HPLC kalibrálható.