Tartalom
- DNS-klónozás: meghatározás és a folyamat áttekintése
- A plazmid vektor módszer
- A PCR (polimeráz láncreakció) módszer
- A plazmidvektor és a PCR DNS klónozási módszerek együttes használata
- Példák a DNS-klónozásra biotechnológia céljából
- Példák DNS-klónozásra kutatás céljából
- Példák a DNS-klónozásra génterápiában
Lehetséges egész organizmusok klónozása, mint például a juh Dolly, de a DNS-klónozás eltérő. Molekuláris biológiai technikákat használ a készítéshez azonos DNS-szekvenciák vagy egyetlen gén másolatai.
Géntechnikai módszerekkel azonosítják és izolálják a DNS genetikai kódjának szegmenseit. A DNS-klónozás ezután a nukleinsavszekvenciákat másolja a szegmensekben.
Az így kapott azonos példányok felhasználhatók további kutatásokra vagy biotechnológiai alkalmazásokra. A lemásolt gén gyakran olyan fehérjét kódol, amely az orvosi kezelések részét képezi. DNS - technológia, beleértve: DNS-klónozás támogatja annak megértését, hogy a gének hogyan működnek, és hogyan befolyásolja az emberek genetikai kódja a test működését.
DNS-klónozás: meghatározás és a folyamat áttekintése
A DNS-klónozás a molekuláris biológiai folyamat, amelynek során a kromoszómákban található DNS-szegmensek azonos másolatait készítik, amelyek a fejlett szervezetek genetikai kódját tartalmazzák.
A folyamat nagy mennyiségben termel cél-DNS-szekvenciák. A DNS-klónozás célja maguk a cél-DNS-szekvenciák előállítása vagy a célszekvenciákban kódolt fehérjék előállítása.
A DNS-klónozásban alkalmazott két módszert nevezzük plazmid vektor és polimeráz láncreakció (PCR). Ban,-ben plazmid vektor módszer szerint a DNS-szálakat elvágjuk restrikciós enzimek DNS fragmensek előállítása céljából, és a kapott szegmenseket a további duplikáció céljából plazmidoknak nevezett klónozó vektorokba helyezzük. A plazmidokat baktériumsejtekbe helyezzük, amelyek előállítják a DNS-kópiákat vagy kódolt fehérjéket.
Ban,-ben PCR módszer, a megkettőzendő DNS-szálak szegmense úgynevezett enzimekkel van megjelölve alapozók. Egy polimeráz enzim másolatot készít a DNS-szál jelölt részéről. Ez a módszer nem használ restrikciós enzimeket, és kis mintákból képes klónozott DNS-t előállítani. Időnként a két DNS-technológiai módszert együttesen alkalmazzák, hogy az egyes reakciók legjobb tulajdonságait beépítsék.
A plazmid vektor módszer
Az eljárás vektora a plazmidra vonatkozik, amelyet a klónozandó cél-DNS-szegmens tartására használnak. A plazmidok kis, kör alakú szálak nem kromoszómális DNS megtalálható számos szervezetben, beleértve a baktériumokat és a vírusokat.
A baktérium-plazmidok a vektor, amelyet a cél-DNS-szegmens beillesztésére használnak baktériumsejtekbe a további sokszorosítás céljából.
A cél-DNS kiválasztása és izolálása: A DNS-klónozási folyamat megkezdése előtt meg kell határozni a DNS-szekvenciákat, különös tekintettel a DNS-szegmensek kezdetére és végére.
Az ilyen DNS-szekvenciák megtalálhatók ismert szekvenciákkal meglévő klónozott DNS felhasználásával vagy a cél-DNS-szekvencia által termelt protein tanulmányozásával. Miután a szekvencia ismert, a megfelelő restrikciós enzimek felhasználhatók.
A cél DNS vágása restrikciós enzimekkel: A restrikciós enzimeket úgy választjuk meg, hogy megkeressük a DNS-kódot a célszekvencia elején és végén.
Amikor a restrikciós enzimek egy bázispárok egy speciális kódolt szekvenciáját találnak, az úgynevezett restrikciós helyeket, akkor kapcsolódnak magukhoz a DNS-hez abban a helyben, és a DNS-molekula körül magukat szélbe szaggatják. A célszekvenciát tartalmazó vágott DNS-szegmensek már megismételhetők.
A plazmidvektor kiválasztása és a cél-DNS beiktatása: Egy alkalmas plazmid ideális esetben ugyanolyan DNS-kódoló szekvenciákat tartalmaz, mint a DNS-szál, amelyből a cél-DNS-t levágták. A plazmid körkörös DNS-szálát ugyanazokkal a restrikciós enzimekkel vágjuk, mint amelyeket a cél-DNS vágására használtak.
A DNS-ligáz enzim A DNS-szegmens összekapcsolódásának elősegítésére szolgál, és a cél-DNS-szegmens végei összekapcsolódnak a plazmid DNS vágott végeivel. A cél DNS a kör alakú plazmid DNS szál részét képezi.
A plazmid behelyezése egy baktériumsejtbe: Miután a plazmid tartalmazza a klónozandó DNS-szekvenciát, a tényleges klónozás az úgynevezett eljárás alkalmazásával történhet bakteriális transzformáció. A plazmidokat bevisszük egy baktériumsejtekbe, például az E. coliba, és az új DNS-szegmensekkel rendelkező sejtek másolatokat és a megfelelő fehérjéket termelnek.
Bakteriális transzformáció során a gazdasejteket és a plazmidokat inkubáljuk együtt testhőmérsékleten körülbelül 12 órán át. A sejtek felszívják a plazmidok egy részét, és saját plazmid-DNS-ként kezelik őket.
A klónozott DNS és fehérjék betakarítása: A legtöbb DNS-klónozáshoz használt plazmid rendelkezik antibiotikumrezisztencia-gének beépülnek a DNS-be. Amint a baktériumsejtek felszívják az új plazmidokat, rezisztenssé válnak az antibiotikumokkal szemben.
Amikor a tenyészetet antibiotikumokkal kezeljük, csak azok a sejtek maradnak életben, amelyek az új plazmidokat felszívják. Az eredmény tiszta baktériumsejtek tenyésztése klónozott DNS-sel. Ezt a DNS-t ezután össze lehet gyűjteni, vagy a megfelelő fehérjét elő lehet állítani.
A PCR (polimeráz láncreakció) módszer
A PCR módszer egyszerűbb és másolja a meglévő DNS-t a helyén. Nincs szükség restrikciós enzimekkel történő vágásra vagy plazmid DNS szekvenciák beillesztésére. Ez különösen alkalmassá teszi a korlátozott számú DNS-szálú DNS-minták klónozását. Noha a módszer klónozza a DNS-t, nem használható a megfelelő fehérje előállításához.
A DNS-szálak feltekeredése: A kromoszómákban lévő DNS szorosan kettős spirál szerkezetű. A DNS-t 96 ° C-ra melegítjük egy ún denaturálási a DNS-molekulát feltekeri és szétválasztja két szálra. Ez az elválasztás azért szükséges, mert egyszerre csak egyetlen DNS-szálat lehet klónozni.
Az alapok kiválasztása: A plazmid-vektor-DNS-klónozáshoz hasonlóan a klónozandó DNS-szekvenciákat is azonosítani kell, különös tekintettel a DNS-szegmensek elejére és végére. A primerek olyan enzimek, amelyek specifikus DNS-kódszekvenciákhoz kapcsolódnak, és azokat ki kell választani a cél-DNS-szegmensek megjelölésére. A jobb oldali primerek a DNS-molekula szekvenciához kapcsolódnak, hogy megjelöljék a célszegmensek kezdetét és végét.
A primerek megkötésére szolgáló reakció lágyítása: A reakciót kb. 55 ° C-ra hűtjük hőkezelés. A reakció lehűlésekor a primerek aktiválódnak, és a cél-DNS-szegmens mindkét végén a DNS-szálhoz kapcsolódnak. Az primerek csak markerekként működnek, és a DNS-szálat nem kell levágni.
A cél-DNS-szegmens azonos példányainak előállítása: Az úgynevezett folyamatban kiterjesztésA reakcióelegyhez hőérzékeny TAQ polimeráz enzimet adunk. A reakcióelegyet ezután 72 ° C-ra melegítjük, aktiválva az enzimet. Az aktív DNS-polimeráz enzim kötődik a primerekhez és átmásolja a közöttük lévő DNS-szekvenciát. A kezdeti DNS-szekvenálási és klónozási folyamat befejeződött.
A klónozott DNS hozamának növelése: A kezdeti lágyítási és meghosszabbítási folyamat viszonylag kevés másolatot hoz létre a rendelkezésre álló DNS-szál szegmensekből. A hozam növelése érdekében további DNS-replikációval a reakciót újra lehűtjük, hogy újraindítsuk a primereket, és hagyjuk, hogy kötődjenek más DNS-szálakhoz.
Ezután a reakcióelegy melegítésével ismét aktiválódik a polimeráz enzim, és további példányok képződnek. Ez a ciklus 25-30 alkalommal megismételhető.
A plazmidvektor és a PCR DNS klónozási módszerek együttes használata
A plazmidvektor módszer a plazmidok felvágására és beillesztésére bőséges kezdeti DNS-ellátáson alapszik. A túl kevés eredeti DNS kevesebb plazmidot eredményez és lassan kezdi a klónozott DNS-termelést.
A PCR módszer nagy mennyiségű DNS-t képes előállítani néhány eredeti DNS-szálból, de mivel a DNS-t nem implantálják egy baktériumsejtbe, a fehérjetermelés nem lehetséges.
Egy kicsi kezdeti DNS-mintából a klónozandó DNS-fragmensekben kódolt fehérje előállításához a két módszer együtt használható, és kiegészítik egymást. Először a PCR-módszert alkalmazzuk egy kis mintából származó DNS klónozására és sok másolat előállítására.
Ezután a PCR-termékeket a plazmidvektor módszerrel használjuk a termelt DNS implantálására olyan baktériumsejtekbe, amelyek előállítják a kívánt fehérjét.
Példák a DNS-klónozásra biotechnológia céljából
A molekuláris biológia génklónozást és DNS replikációt alkalmaz orvosi és kereskedelmi célokra. A klónozott DNS-szekvenciájú baktériumokat gyógyszerek előállítására és azoknak a anyagoknak a helyettesítésére használják, amelyeket a genetikai rendellenességgel küzdő emberek nem képesek előállítani.
A tipikus felhasználások a következők:
A biotechnológia a génklónozást is használja a mezőgazdaságban új tulajdonságok létrehozására növényekben és állatokban, vagy a meglévő tulajdonságok javítása érdekében. Ahogy egyre több gént klónoznak, az esetleges felhasználások száma exponenciálisan növekszik.
Példák DNS-klónozásra kutatás céljából
A DNS-molekulák az anyag kis részét alkotják egy élő sejtben, és a sok gén hatásait nehéz elkülöníteni. A DNS-klónozási módszerek nagy mennyiségű specifikus DNS-szekvenciát szállítanak a tanulmányozáshoz, és a DNS ugyanúgy termel proteineket, mint az eredeti sejtben. A DNS-klónozás lehetővé teszi ennek a műveletnek a különféle génekre történő izolált vizsgálatát.
A tipikus kutatási és DNS-technológiai alkalmazások között szerepel a következők vizsgálata:
Ha több DNS-szekvenciát klónozunk, könnyebb megtalálni és klónozni további szekvenciákat. A meglévő klónozott DNS-szegmensek felhasználhatók annak meghatározására, hogy egy új szegmens megfelel-e a réginak, és mely részek különböznek egymástól. A cél-DNS-szekvencia azonosítása akkor gyorsabb és pontosabb.
Példák a DNS-klónozásra génterápiában
Ban ben génterápia, klónozott gént mutatnak be egy szervezet sejtjeiben, amelynek természetes génje megsérült. Egy létfontosságú gén, amely egy adott szervezet működéséhez szükséges fehérjét termeli, mutálódhat, megváltozhat a sugárzás által vagy befolyásolhatja a vírusok.
Ha a gén nem működik megfelelően, akkor egy fontos anyag hiányzik a sejtből. A génterápia megpróbálja cserélje ki a gént olyan klónozott változatra, amely előállítja a kívánt anyagot.
A génterápia még mindig kísérleti jellegű, és kevés beteget gyógyítottak meg a technikával. A problémát az egészséges állapotért felelős egyetlen gén azonosítása és a gén sok példányának a megfelelő sejtekbe történő szállítása jelenti. Ahogy a DNS-klónozás egyre szélesebb körben elterjedt, a génterápiát számos speciális helyzetben alkalmazták.
A legutóbbi sikeres pályázatok tartalmazzák:
A génterápia a DNS-klónozás egyik legígéretesebb alkalmazása, ám valószínűleg más új felhasználások is szaporodnak, mivel több DNS-szekvenciát tanulmányoznak és funkciójukat meghatározzák. A DNS-klónozás a szükséges mennyiségben biztosítja a géntechnológia alapanyagát.
Ha a gének szerepe ismert és a hibás gének helyettesítésével biztosítható a megfelelő működés, sok krónikus betegséget és akár a rákot genetikai szinten is támadhatják meg és kezelhetik a DNS-technológia segítségével.
Kapcsolodo tartalom: