Tartalom
A nagyteljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC) laboratóriumi módszer a vegyületek elválasztására és azonosítására. Ez egy oszlopkromatográfiás módszer, amely a vegyületeknek az oldatban lévő különféle polaritásokra támaszkodik, hogy elválaszthassák őket. A HPLC különbözik a szokásos oszlopkromatográfiától, mivel nyomást alkalmaz az oldat gyorsabb erõszakolására az oszlopon, ezért gyorsabb, és néha pontosabb eredményeket ad. A cél az, hogy elkülönítsék a vegyületeket az oszlopban, és elhagyják őket külön-külön.
együttes eluálás
A HPLC sebessége és a vegyületek különféle polaritásokra támaszkodása miatt két, hasonló szerkezetű és polaritású vegyület ugyanakkor vagy csaknem ugyanabban az időben léphet ki a kromatográfiás készülékből. Ezt koelúciónak nevezzük. Az átgondolás megnehezíti, hogy pontosan meghatározzuk a keverék mely részét eluálódik az adott ponton.
Adsorbált vegyületek
A HPLC általában üveg oszlopot használ, amely különféle anyagból készült gyöngyökkel van tele. Az oszlopon át kényszerített keverékek vegyi anyagokkal rendelkeznek, amelyek különböző erősségűekhez kötődnek a gyöngyökhöz. A kötés erőssége, amely a polaritás hasonlóságától függ, meghatározza, hogy a vegyi anyag milyen hosszú ideig kötődik a gyöngyhöz, mielőtt felszabadulna. Egyes vegyületek annyira erősen kötődnek, hogy gyakorlatilag soha nem szabadulnak fel az oszlop gyöngyéből, és soha nem mérik az oszlopot kilépő oldatban.
Költség
A tipikus laboratóriumi elválasztási technikák magukban foglalják egy vizsgálat vagy egy elválasztási módszer kifejlesztését, majd ezt a vizsgálatot az egyes vegyületek elválasztására az oldatból. Ez általában több olyan megoldást eredményez, amelyeken is eljárásokat kell végezni, és ez a komplexitás exponenciális növekedését eredményezi. Noha a HPLC gyakran egyszerűsítheti és felgyorsíthatja ezt a folyamatot, a HPLC készülék kifejlesztésének költsége óriási lehet. A HPLC készülék kifejlesztése, bár sokkal hatékonyabb, sokkal költségesebb, mint a vegyületek elválasztására szolgáló más vizsgálatok kidolgozása. Ez sok kis magántulajdonban lévő laboratórium számára pénzügyi szempontból nem életképes.
Bonyolultság
A HPLC-t nemcsak az egyszerű vegyületek elválasztására használják, hanem arra is, hogy specifikus fehérjéket izoláljanak egy sejtkeverékből. Ebben az esetben az oszlopban levő gyöngyöket általában begyűjtik az összegyűjtéséhez szükséges fehérjére specifikus antitesttel. A fehérjék megkötik az antitesteket, és a fennmaradó oldatot átjuttatják az oszlopon, majd a fehérjéket egy másik oldattal szabadítják fel és összegyűjtik. Ehhez magasan képzett szakemberre van szükség az oszlop állandó ellenőrzéséhez és annak ellenőrzéséhez, hogy a folyamat pontosan a tervek szerint működik-e.