Tartalom
A gélelektroforézis során a DNS vagy fehérjék mintáit elválasztják - általában méretük alapján - olyan elektromos mező alkalmazásával, amely a gélen keresztül vándorol. A gél-elektroforézis alkalmazása rutinszerű az orvosbiológiai kutatólaboratóriumokban, és különféle kérdések megválaszolására szolgál, tehát valóban nincs egyetemes módszer az eredmények elemzésére.
Különböző technikák, például a Western-blot, a Northern-blot és a Southern-blot, mindegyik magában foglalja a gélelektroforézist.
Ha a DNS-minták agarózgél-elektroforézisével foglalkozik, akkor a leggyakoribb eljárásnak tipikusan legalább két dolgot meg kell tennie: 1) meg kell különböztetnie a nem vágott plazmidokat a betétektől, a réselt plazmidokat és a vágott plazmidokat, és 2) meg kell becsülnie a különféle DNS-fragmensek egy standard görbe Excel vagy kalkulátor segítségével.
Itt az, hogy működik.
Ellenőrizze a laboratóriumi notebookot, hogy meghatározza, mely mintákat töltött be az egyes sávokba. Amikor betöltötte a gélhez tartozó kutakat, meg kellett volna jegyeznie az egyes sávok / minták azonosítását.
Határozza meg, melyik sáv tartalmazza a DNS-szabványok "létráját". Ezek ismert hosszúságú fragmentumok; ezek migrációs távolsága felhasználható a mintafragmensek méretének meghatározására egy standard görbe Excel vagy más számológép segítségével.
Vonalzó segítségével mérje meg a képen a kutak és a követő festék közötti távolságot, amely tovább halad a DNS-sávok bármelyikénél (más szóval a gél alján található). Jegyezzük fel ezt a számot - az Ön által használt egységek nem fontosak.
Mérje meg a képen lévő távolságot a kutaktól a "létra" minden sávjáig, majd ossza meg ezt a távolságot a követő festékszalag megtett távolságával. Ez a számítás megadja az egyes sávok relatív mobilitását.
Példa: Tegyük fel, hogy a nyomkövető festék sáv 6 hüvelyk ment, és van három sávunk, amelyek 5, 4,5 és 3,5 hüvelyk.
Mi a relatív mobilitásuk? Válasz: Osztjuk el az 5, 4,5 és 3,5 értékeket 6-mal, hogy 0,833, 0,75 és 0,5833 relatív mobilitást kapjunk.
Írja be a relatív mobilitást a táblázatkezelő programba (Excel vagy más hasonló program, amelyet használ), a létrán lévő egyes fragmensek méretének kilobázispontokkal együtt.
A gyártó megadja az egyes részek méretét az általuk szállított létrákban, tehát már rendelkeznie kell ezekkel az információkkal.
Ábrázolja az adatokat a relatív mobilitással az x-en és a méretet kilobázisban az y-n.
Használja a táblázatkezelő Trendline funkcióját az egyenlet illesztéséhez az adatokhoz. Ennek az egyenletnek teljesítmény-egyenletnek (pl. X ^ -2) kell lennie, és viszonylag jól illeszkednie kell az adatokhoz (R-együttható legalább 0,9). Ez görbét és egy standard görbét hoz létre az Excelben.
Nézze meg a mintáinak megfelelő sávokat.
Ne feledje, hogy a kisebb DNS-fragmensek távolabb jutnak a gélen, mint a nagy DNS-fragmensek, tehát a követő festékhez legközelebbiek a legkisebbek. Ne feledje azonban, hogy ha a plazmid (kör alakú) DNS nem vágott, akkor "szuper-becsavarodott" lesz vagy összecsavarodik, mint egy telefonkábel, ami valójában elmozdulást okoz messzebb mint az azonos méretű lineáris DNS.
Hasonlóképpen, egy "kimagasztott" plazmid, amelyet nem teljesen vágtak ki, a rövidebb távolság, mint az azonos méretű lineáris DNS-nél. Következésképpen nem tudja megbecsülni a gélből kivágott plazmidok méretét.
Egyeztesse az egyes sávok sávjait a mintába, amelyet az adott sávba töltött be, és ellenőrizze, hogy látja-e az, amit elvárhatott volna. Ez a kísérlet természetétől függ.
Általában azonban, ha egy inszertáló plazmidot két restrikciós enzimmel emésztett, akkor arra számíthat, hogy az inszert megszabadul a plazmidtól.
Mivel sokkal kisebb, mint a plazmid, akkor arra számíthat, hogy két sávot lát a sávban, az egyik a felső és a másik az alsó közelében. Csak egy restrikciós enzimmel vágott plazmidnak csak egyetlen sávot kell képeznie, amely kissé távolabb halad, mint a két restrikciós enzimmel vágott plazmid, de közel sem az inszerthez.
Mérje meg a lyukaktól a vágott plazmidig mért távolságot, és helyezze be a sávokat az vonalzóval. Osszuk el ezeket a számokat a nyomkövetõ festék megtett távolságával, hogy meghatározzuk a betétek és a vágott plazmidok relatív mobilitását.
Csatlakoztassa a betétek és a plazmidok relatív mobilitását a táblázatkezelő programban számított egyenletéhez. Ennek a számításnak becslést kell adnia ezen plazmidok méretére.