Tartalom
A Western blot az egyik leggyakoribb eljárás a biokémiai laboratóriumokban. Alapvetően elválasztja a fehérjéket a mintából méret szerint, majd ellenanyagok segítségével teszteli annak meghatározására, hogy van-e egy adott fehérje. Nemcsak kutatásban, hanem orvosi vagy diagnosztikai laboratóriumokban is hasznos; mind a HIV, mind a Lyme-betegség tesztjei tartalmaznak enzim-kapcsolt immunszorbens teszt (ELISA) tesztet, amelyet Western-blot követ, ha az ELISA teszt pozitív. Népszerűsége ellenére a Western blotnak számos hátránya van.
Nonquantitative
A klasszikus Western blot nem kvantitatív. Más szavakkal, bár meg tudják mondani a kutatóknak, hogy van-e egy adott fehérje, nem teszik lehetővé annak meghatározását, hogy mekkora a fehérje jelenléte. Néhány biotechnológiai vállalat most olyan készleteket árusít, amelyek lehetővé teszik a kutatók vagy laboratóriumi szakemberek számára, hogy a jelen lévő fehérjemennyiséget egy standard görbe segítségével számszerűsítsék - de ez csak akkor működik, ha ugyanazon fehérje tiszta mintái állnak rendelkezésre. Ezenkívül egy fehérje molekulatömegét csak Western blot-kal lehet becsülni, nem pedig pontosan meghatározzuk, mint a tömegspektrometriával.
Az antitestek
Western blot csak akkor hajtható végre, ha rendelkezésre állnak a kérdéses protein elleni primer antitestek. Noha a biotechnológiai cégeknél sokféle fehérje ellenanyaga beszerezhető, ezek nem olcsók; ha egy adott fehérje számára nem állnak rendelkezésre primer antitestek, akkor nem lehet Western-blotot elvégezni az adott fehérjére. Ezenkívül a kutatók azt is megkérdezik, hogy egy fehérje valamilyen módon módosult-e, ha például foszforilálódtak (például foszfátcsoport kapcsolódott hozzá) - és a Western blot módszerrel szükségesek-e a módosított proteinre specifikus antitestekre fehérje.
Kiképzés
A Western blot megfelelő végrehajtása és a jó eredmények elérése nehéz lehet, ezért a személyzetnek jól képzettnek kell lennie.Ebben, mint sok másban, a tapasztalat talán a legjobb oktató; még a tapasztalt szakemberek számára is a Western blot időigényes. A kísérlet gél-elektroforézis-része például egy-két órát vesz igénybe. Természetesen más feladatok is elvégezhetők, míg a gél fut, de a kísérletnek még sok időbe telik az eredmények elérése.
Egyéb korlátozások
Az antitestek néha mutatnak céltól eltérő kötődést, ami gyengébb eredményeket eredményezhet. Sőt, a Western blot alkalmazásával egy specifikus protein elleni antitestet használ, tehát az eredmények csak azt fogják megmondani, ha az adott protein jelen volt-e. A nagy felbontású tömegspektrometria ezzel szemben felfedi a mintában lévő összes fehérjét, és a klasszikus Western-blottal ellentétben kvantitatív. Fontos, hogy ne felejtsük el, hogy a tömegspektrometria sokkal drágább, és technikai szempontból is nagyobb kihívást jelent a Western-blotoláshoz képest.