Tartalom
- Restrikciós enzimek és restrikciós helyek
- A helyes orientáció
- A ragacsos végződések ligálása kevesebb DNS-t igényel
- Különböző enzimek adhatják ugyanazt a ragacsos végét
A molekuláris klónozás egy általános biotechnológiai módszer, amelyet minden hallgatónak és kutatónak ismernie kell. Molekuláris klónozás egy olyan típusú enzim felhasználásával, amelyet restrikciós enzimnek nevezünk, hogy az emberi DNS-t fragmentumokká vágjuk, amelyeket azután be lehet illeszteni egy baktériumsejt plazmid DNS-ébe. A restrikciós enzimek a kettős szálú DNS-t felére vágják. A restrikciós enzimtől függően a vágás akár ragadós, akár tompa végeket eredményezhet. A ragacsos végek jobban használhatók a molekuláris klónozásban, mivel biztosítják, hogy az emberi DNS-fragmentum a helyes irányba illeszkedjen a plazmidba. A ligációs folyamat vagy a DNS-fragmensek fuzionálása kevesebb DNS-t igényel, ha a DNS-nek ragacsos vége van. Végül, több ragacsos végű restrikciós enzim ugyanazt a ragacsos végt képes előállítani, annak ellenére, hogy mindegyik enzim különböző restrikciós szekvenciát ismeri fel. Ez növeli annak valószínűségét, hogy az érdekes DNS-régiót ragacsos végű enzimek kivágják.
Restrikciós enzimek és restrikciós helyek
A restrikciós enzimek olyan enzimek, amelyek vágják fel a specifikus szekvenciákat a kettős szálú DNS-en, és a DNS-t felére vágják ezen a szekvencián. A felismert szekvenciát restrikciós helynek nevezzük. A restrikciós enzimeket endonukleázoknak nevezzük, mivel azok kettős szálú DNS-t vágnak, amely a DNS normális módon létezik, a DNS végei között elhelyezkedő helyeken. Több mint 90 különböző restrikciós enzim létezik. Mindegyik felismer egy különálló restrikciós helyet. A restrikciós enzimek 5000-szer hatékonyabban hasítják meg a megfelelő restrikciós helyeket, mint más helyek, amelyeket nem ismernek fel.
A helyes orientáció
A restrikciós enzimek két általános osztályba sorolhatók. Vagy ragasztósavokra vagy tompa végekre vágják a DNS-t. A ragacsos végnek rövid nukleotid régiója van, a DNS építőkövei, amely pár nélkül van. Ezt a páratlan régiót túlnyúlásnak nevezik. Azt mondják, hogy a túlnyúlás ragadós, mert azt akarja, és párosul egy másik ragacsos véggel, amelynek komplementer túlnyúlási szekvenciája van. A ragacsos végek olyanok, mint a rég elveszett ikrek, akik egymás után szorosan átölelnek. Másrészt a tompa vég nem ragadós, mert az összes nukleotid már párosítva van a DNS két szálja között. A ragacsos végek előnye, hogy az emberi DNS egy fragmentuma csak egy irányban fér bele a baktérium plazmidba. Ezzel szemben, ha mind az emberi DNS, mind a baktérium plazmidnak tompa végei vannak, az emberi DNS beilleszthető fej-farok vagy farok-fej felé a plazmidba.
A ragacsos végződések ligálása kevesebb DNS-t igényel
Noha a ragasztott végű DNS-nek könnyebb idő megtalálni egymást „ragasztósságuk miatt”, sem a ragacsos, sem a tompa végek nem képesek összeolvadni folyamatos DNS darabká. Folyamatos, teljesen összekapcsolt DNS-darab kialakításához enzimhez ligandnak nevezzük. A ligázok a nukleotidok gerincét a ragacsos vagy tompa végén összekötik, és így folyamatos nukleotidláncot képeznek. Mivel a ragacsos végek gyorsabban találják meg egymást vonzerejük miatt, a ligáláshoz kevesebb emberi DNS és kevesebb plazmid DNS szükséges. A DNS tompa végei és a plazmidok kevésbé valószínű, hogy megtalálják egymást, és így a tompa végek ligálása megköveteli, hogy több DNS kerüljön a kémcsőbe.
Különböző enzimek adhatják ugyanazt a ragacsos végét
A restrikciós helyek az organizmusok teljes genomjában megtalálhatók, de nem vannak egyenletes távolságra. A plazmidokban úgy tervezhetők, hogy közvetlenül egymás mellett helyezkedjenek el. Azoknak a tudósoknak, akik ki akarják vágni az emberi DNS egy részét az emberi genomból, meg kell találniuk azokat a restrikciós helyeket, amelyek a fragmentum régiója elõtt és hátul vannak. Amellett, hogy a DNS-fragmenst a helyes irányba illesztik be, a különböző ragacsos végű enzimek ugyanazt a ragacsos végt hozhatják létre, még akkor is, ha különböző restrikciós szekvenciákat ismernek fel. Például a BamHI, a BglII és a Sau3A eltérő felismerési szekvenciákkal rendelkezik, de ugyanazt a GATC ragasztó végét eredményezik. Ez növeli annak valószínűségét, hogy ragacsos vég restrikciós helyek lesznek, amelyek az érdeklődő emberi géned mellett vannak.